1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物性食品中常山酮?dú)埩袅繖z測的制樣和高效液相色譜測定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于雞的肌肉和肝臟組織中常山酮?dú)埩袅康臋z測。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的xin版本。凡是不注日期的引用文件，其xin版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T 1.1-2000標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則

GB/T 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法

3 原理

試料中殘留的常山酮，用胰蛋白酶酶解，乙酸乙酯提取，液液萃取，HLB柱凈化，高效液相色譜-紫外測定，外標(biāo)法定量。

4 試劑和材料

以下所用試劑，除特殊注明外均為分析純試劑，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

4.1 氫溴suan常山酮對照品：含量≥99.6%。

4.2 甲醇：色譜純。

4.3 乙酸乙酯：色譜純。

4.4 乙腈：色譜純。

4.5 無水碳酸鈉

4.6 胰蛋白酶1000U/mg。

4.7 乙酸銨

4.8 乙酸

4.9 甲苯

4.10 HLB固相萃取柱：500mg/6mL,或相當(dāng)者。

4.11 0.25mol/L乙酸銨緩沖液：取乙酸銨19.27g,加乙酸30mL,用水溶解并稀釋至1000mL,用乙酸調(diào)PH至4.3。

4.12 0.125mol/L乙酸銨緩沖液：取0.25mol/L乙酸銨緩沖液500mL,用水溶解并稀釋至1000mL。

4.13 10%碳酸鈉溶液：取無水碳酸鈉10g,用水溶解并稀釋至100mL。

4.14 流動(dòng)相：取乙腈250mL、0.25mol/L乙酸銨緩沖液150InL和水600mL,混勻，用冰乙酸調(diào)PH至4.3,濾膜過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.15 200ug/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密稱取氫溴suan常山酮標(biāo)準(zhǔn)品10mg,于50ml棕色量瓶中，用0.25mol/L乙酸銨緩沖液溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為200ug/mL的常山酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液。密封，用鋁箔包裹，2～8℃避光保存，有效期6個(gè)月。

4.16 10ug/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密量取200ug/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.5mL于10mL棕色量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為10ug/mL常山酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液。密封，用鋁箔包裹，2～8℃避光保存，有效期為6個(gè)月。

5 儀器和設(shè)備

5.1 高效液相色譜儀：配紫外檢測器。

5.2 分析天平：感量0.00001g。

5.3 天平：感量0.01g。

5.4 離心機(jī)

5.5 均質(zhì)機(jī)

5.6 渦旋振蕩器

5.7 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

5.8 氮吹儀

5.9 固相萃取裝置

5.10 恒溫水浴箱

5.11 濾膜：0.45um。

6 試料的制備與保存

6.1 試料的制備

取適量新鮮或解凍的空白或供試組織，絞碎，并使均質(zhì)。

—取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試料。

—取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料。

—取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。

6.2 樣品的保存

-20℃以下保存。

7 測定步驟

7.1 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取10ug/mL的常山酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用甲醇溶解并稀釋,配制成濃度為50、100、300、500和1000ug/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1.0mL,分別加至經(jīng)提取、凈化步驟處理的空白試料洗脫液中，于38℃水浴下氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相1.0mL溶解殘余物，供高效液相色譜法測定。以測得峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

7.2 提取

稱取試料(4±0.04)g,于100mL離心管中，加胰蛋白酶50mg,加水2mL(肝臟組織)或水10mL(肌肉組織)，渦動(dòng)1min,用10%碳酸鈉溶液調(diào)PH至8.0,于40℃水浴下酶解3h。取出，放至室溫，加10%碳酸鈉溶液2mL,渦動(dòng)1min,再加乙酸乙酯20mL,渦動(dòng)10s,在冰水浴中靜置3min,立即2000r/min離心2min,將上清液轉(zhuǎn)入100mL分液漏斗中。下層液用乙酸乙酯20mL重復(fù)提取一次，合并兩次上清液于同一分液漏斗中，加0.125mol/L乙酸銨溶液10mL,振搖1min,靜置2min,收集下層水相。再加0.125mol/L乙酸銨溶液10mL,重復(fù)萃取一次，合并兩次水相，轉(zhuǎn)至雞心瓶中，于38℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除盡殘余的乙酸乙酯，備用。

7.3 凈化

HLB柱依次用甲醇3mL、水3mL和0.125mol/L乙酸銨3mL活化，取備用液過柱，控制流速1mL/min,用甲苯2mL洗滌，擠干，用甲醇3mL洗脫，收集洗脫液，于38℃氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相1.0mL溶解殘余物，混勻，濾膜過濾，供高效液相色譜法測定。

7.4 測定

7.4.1 色譜條件

色譜柱：C₁₈(150mm×3.9mm,粒徑4um),或相當(dāng)者；

流動(dòng)相：乙腈-0.25mol/L乙酸銨緩沖液-水；

流速：1.0mL/min；

柱溫：30℃；

檢測波長：243nm；

進(jìn)樣體積：25uL。

7.4.2 測定法

取試樣溶液和相應(yīng)的對照溶液，做單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按外標(biāo)法，以峰面積計(jì)算。對照溶液及試樣溶液中常山酮響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。

7.5 空白試驗(yàn)

除不加試料外，采用*相同的步驟進(jìn)行平行操作。

8 結(jié)果計(jì)算和表述

試料中常山酮的殘留量(ug/kg)：按下式計(jì)算

式中：

X—供試試料中常山酮的殘留量，ug/kg;

C—試樣溶液中常山酮濃度，ug/mL;

V—溶解殘留物所用流動(dòng)相體積，mL；

m—供試試料質(zhì)量，g。

注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白試料值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

9 檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

9.1 靈敏度

本方法檢測限為25ug/kg；定量限為50ug/kg。

9.2 準(zhǔn)確度

本方法在50～500ug/kg添加濃度水平上回收率為80%～110%。

9.3 精密度

本方法的批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%,批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。